Ricerca scientifica

Un modello animale sperimentale sviluppato all’Ospedale Bambino Gesù permette di valutare con accuratezza le mutazioni genetiche alla base della malattia

Le mutazioni nei geni COL4A1 e COL4A2, che codificano per componenti fondamentali del collagene di tipo IV, possono provocare una sindrome rara e complessa, caratterizzata da fragilità dei piccoli vasi cerebrali, emorragie intracraniche, malformazioni neurologiche e problemi oculari. Una patologia multisistemica che può manifestarsi già prima della nascita e che, ancora oggi, pone numerose sfide diagnostiche e cliniche. Nonostante i progressi della genetica, molte varianti individuate nei pazienti restano di significato incerto. I test identificano la mutazione, ma spesso non è chiaro se sia davvero responsabile della malattia.

Proprio per colmare questo divario tra genetica e clinica, un gruppo di ricerca dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù di Roma ha sviluppato un nuovo approccio sperimentale basato sul modello animale dello zebrafish, capace di riprodurre rapidamente in vivo gli effetti delle varianti genetiche umane.

Lo studio, recentemente pubblicato sulla rivista scientifica Matrix Biology e finanziato dall'Associazione Famiglie COL4A1-A2, ha mostrato come questo modello sia in grado di riprodurre molte delle caratteristiche della malattia, tra cui fragilità vascolare cerebrale, anomalie dello sviluppo del cervello e difetti oculari, aprendo la strada a strumenti più rapidi per validare le mutazioni e comprendere i meccanismi biologici alla base della sindrome.

Ne parliamo con Antonella Lauri, dirigente biologo di ricerca dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù e coordinatrice dello studio, che spiega come questo progetto possa aiutare i clinici a interpretare meglio le varianti genetiche e offrire nuove prospettive di diagnosi e ricerca per i pazienti e le loro famiglie.

DISTINGUERE LE MUTAZIONI PATOGENE PER MIGLIORARE LA DIAGNOSI

La sindrome COL4A1/A2 è una patologia complessa causata da mutazioni, ereditarie o de novo, nei geni COL4A1 e COL4A2, che codificano per il collagene IV alpha1 e alpha2. Queste alterazioni rendono fragile la membrana basale dei piccoli vasi cerebrali, con conseguenze anche prenatali, tra cui emorragie, malformazioni cerebrali, deficit cognitivi ed epilessia spesso farmaco-resistente. La malattia può inoltre coinvolgere altri organi come occhi, reni e muscoli.

“Ad oggi, però, conosciamo ancora poco dello spettro di mutazioni e patologie di tessuti e organi, della relazione stessa tra specifiche mutazioni e manifestazioni cliniche e dei meccanismi della malattia”, ci spiega Lauri. “Se alcune varianti genetiche, come quelle che alterano le glicine del collagene, sono chiaramente patogenetiche, molte altre, che coinvolgono anche aminoacidi diversi dalle glicine e poco studiati, restano di significato incerto, pur essendo sempre identificate dai test genetici. Si tratta di un numero importante di varianti non validate, che supera di molto il centinaio. Per questo, uno dei bisogni clinici più urgenti è fornire una diagnosi certa e basata su evidenze funzionali, che permetta una presa in carico adeguata di ogni paziente che attende un monitoraggio mirato e una consulenza genetica informata. Inoltre, nonostante i vasi cerebrali sono chiaramente un organo altamente interessato e un bersaglio della malattia, non esistono oggi protocolli standardizzati di presa in carico che permettano di valutare preventivamente le malformazioni vascolari, per mancanza di evidenze scientifiche. L’epilessia resta spesso senza cura. Questi sono tutti bisogni non risposti delle famiglie, che necessitano ricerca. L’innovativa pipeline di genomica funzionale, che con il mio team di ricerca all’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù IRCCS abbiamo messo su nell’ultimo anno, cerca di venire incontro a tutte queste esigenze. Abbiamo sviluppato una pipeline di genomica funzionale basata sul modello zebrafish. Questo organismo, geneticamente simile all’uomo, può aiutare i clinici perché permette di "testare" le varianti umane in un organismo vivente in tempi relativamente rapidi. A partire dalla semplice informazione dei test genetici, possiamo valutare in tempi brevi l’impatto delle varianti sull’intero organismo, contribuendo a distinguere e identificare le varianti patogenetiche. I nostri saggi, frutto del primo anno di ricerca, permettono già di analizzare la suscettibilità a emorragie e lo sviluppo di patologie oculari, e iniziano a rivelare anche alterazioni strutturali delle arterie cerebrali. Queste informazioni possono diventare fondamentali per supportare il parere e l’esperienza dei clinici nella diagnosi e nel monitoraggio dei pazienti. Nella fattispecie, abbiamo dimostrato che i nostri saggi qualitativi e funzionali sono in grado di determinare suscettibilità a emorragie più o meno gravi e sviluppo di patologia oculare. Inoltre, grazie alla trasparenza degli embrioni di zebrafish, possiamo osservare in vivo l’intero sistema vascolare cerebrale, ottenendo per la prima volta una visione diretta delle alterazioni che possono essere alla base degli eventi emorragici e che potrebbero essere un campanello d’allarme, una volta fornita la diagnosi con una variante validata, per monitorare la progressione della malattia”.

PERCHÉ PROPRIO LO ZEBRAFISH PER STUDIARE LA MALATTIA

“La scelta dello zebrafish (Danio rerio) come organismo modello non è casuale”, prosegue la ricercatrice. “Questo piccolo pesciolino si adatta perfettamente alla stabulazione controllata in laboratorio e offre vantaggi strategici unici rispetto ai modelli animali classici: 
•    similitudine genetica: nonostante la distanza evolutiva, lo zebrafish condivide circa il 70% del genoma con l’essere umano e oltre l’80% dei geni associati a malattie umane ha un equivalente nel pesce;
•    trasparenza ottica: gli embrioni sono trasparenti. Questo vantaggio è di fondamentale rilevanza nello studio della sindrome COL4A1/A2: e sta per esempio nella possibilità di mappare l'intero letto vascolare cerebrale che permette di individuare alterazioni arteriose, anche quelle subdole, ma possibilmente dotate di un significativo valore prognostico. Tali anomalie, difficilmente apprezzabili nella loro interezza e nel loro contesto fisiologico nei modelli murini, risultano invece chiaramente visibili e quantificabili nello zebrafish. Questa caratteristica permette l'osservazione in vivo e in tempo reale dello sviluppo di organi complessi tramite tecniche di microscopia avanzata, evitando procedure invasive e preservando l'integrità dei tessuti. Questo è per esempio particolarmente rilevante per il letto vascolare cerebrale nel caso della sindrome COL4A1/A2, che può presentare alterazioni anche subdole delle arterie cerebrale che possono però avere un potere prognostico importante e che non è così facile da apprezzare nella sua interezza e nel suo contesto in modelli murini;
•    manipolazione genetica all'avanguardia: grazie a tecnologie come CRISPR/Cas9, è possibile generare modelli di patologie umane in tempi estremamente ridotti e con alta efficienza, permettendo lo studio funzionale di specifichi difetti (mutazioni) genetiche;
•    efficienza e robustezza statistica: lo zebrafish ha un ciclo riproduttivo rapido e produce una progenie numerosa (centinaia di uova per accoppiamento). In 48-72 ore è possibile analizzare lo sviluppo di tessuti complessi e le relative risposte a stimoli esterni. Ciò garantisce una solidità statistica superiore e un'accelerazione significativa dei tempi di ricerca;
•    screening farmacologico ad alto rendimento: le dimensioni ridotte di embrioni e larve e l’assorbimento di molte molecole direttamente dall’acqua consentono l'utilizzo di piastre multipozzetto per testare simultaneamente migliaia di molecole candidate a possibili farmaci. Grazie all'automazione delle analisi comportamentali e della microscopia, lo zebrafish ha dimostrato di contribuire ad accelerare l'identificazione di nuovi approcci terapeutici, anche nel contesto di malattie rare, che spesso restano all’oscuro di grandi interessi farmaceutici e quindi di grossi budget”. 

DALLA RICERCA ALLA CURA. L’ IMPATTO PER PAZIENTI E FAMIGLIE

“FishCOLler” è la prima ricerca italiana sulla sindrome COL4A1/A2, sviluppata presso il laboratorio dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù grazie alla collaborazione tra l’Associazione Famiglie COL4A1-A2 e Telethon. 

“Il progetto nasce con un obiettivo preciso, dare risposte concrete alle famiglie, integrando ricerca di eccellenza e bisogni reali dei pazienti”, continua Lauri. “Sono felice di condividere che dal primo studio pilota che abbiamo concluso, adesso abbiamo costruito una rete di collaborazione che si fonda sulla validazione funzionale delle varianti e lo studio dei meccanismi nel nostro laboratorio, ma mette insieme necessità e scambi con clinici di almeno altri 5 centri di riferimento italiani e anche in Europa. Un impatto importante è aver dato una voce e una presenza scientifica alle famiglie, garantendo visibilità e rappresentanza internazionale. Abbiamo avviato un percorso di ricerca strettamente integrato con i bisogni dell’Associazione, che permette alle famiglie italiane di essere parte attiva nel panorama medico-scientifico internazionale. Nella nostra ricerca, le varianti genetiche dei pazienti (non solo italiani, ma anche delle associazioni francese e americana con cui collaboriamo) verranno studiate e caratterizzate funzionalmente, contribuendo alla conoscenza globale della malattia. Allo stesso tempo, il coinvolgimento in reti e incontri internazionali e la costruzione di collaborazioni con clinici, genetisti e ricercatori permettono di integrare i nostri modelli con le ricerche esistenti e di posizionare l’Italia, insieme ai bisogni delle nostre famiglie, come parte attiva nella ricerca d’avanguardia sulla COL4A1/A2. Un altro impatto concreto è migliorare la diagnosi e la gestione della malattia e accelerare il percorso verso una cura. Di fatto il progetto risponde a un bisogno cruciale delle famiglie: superare l’incertezza diagnostica e la mancanza di risposte. Oggi molti pazienti non ricevono una diagnosi chiara né strumenti per prevedere l’evoluzione della malattia e ottimizzare la gestione clinica. “FishCOLler” inizia a colmare questo gap generando dati funzionali sull’impatto delle varianti genetiche riscontrate nei pazienti e lo fa nell’intero organismo, chiarendo i meccanismi biologici alterati durante lo sviluppo e alla base della malattia e supportando così una diagnosi più informata per clinici e famiglie. Attraverso la condivisione dei dati e un dialogo continuo tra ricerca, clinica e associazioni, abbiamo avviato un percorso che ci auspichiamo arrivi direttamente dai banconi di laboratorio fino ai clinici, in Italia e all’estero, contribuendo a una diagnosi più precisa, all’aggiornamento di linee guida condivise e a una presa in carico più efficace dei pazienti. Inoltre, grazie allo sviluppo dei nostri modelli innovativi e rapidi che studiano alterazioni su tutto l’organismo in pochi giorni sperimentali e alla rete di collaboraizoni e scambi a livello internazionale, gli sviluppi prossimi del progetto consentiranno, come stiamo inizando a fare, di testare rapidamente ipotesi terapeutiche e identificare potenziali bersagli molecolari. Mediante condivisione, questo integra gli sforzi che vengono fatti in altri modelli sperimentali a livello mondiale e può accellerare concretamente il percorso verso futuri studi clinici. Penso in sintesi che FishCOLler non sia semplicemente un progetto di ricerca, ma vuole essere un vero servizio per le famiglie, come dovrebbe essere la ricerca traslazionale: da un lato dà visibilità e rappresentanza scientifica nel panorama medico-scientifico internazionale, dall’altro produce strumenti concreti per migliorare diagnosi e cura, riducendo tempi e incertezze”.

LA FORZA DI UN TEAM DI RICERCA TUTTO AL FEMMINILE

“Sebbene non vi sia stata una scelta ideologica “a priori”, il team del progetto FishCOLler, guidato da me e composto da tante giovani ricercatrici, riflette un trend crescente di presenza e capacità femminile nella ricerca biomedica italiana. Devo dire che questo elemento, spesso sottovalutato, in questo caso ha fatto la differenza. Si è creata fin da subito una forte sinergia tra le nostre ricercatrici e le mamme che sostengono il progetto, e che per prime hanno sognato di avviare la ricerca su questa malattia in Italia. Entrambi i gruppi  (di ricerca e l’associazione delle famiglie) sono uniti dalla stessa urgenza: dare risposte concrete e costruire il primo percorso di ricerca italiano dedicato alla malattia, che incarna di fatto quella tenacia tutta femminile nell’iniziare e coltivare con grinta un progetto da zero, partito da un sogno difronte ad un’importante necessità e ostacoli. Mi piace pensare che ci sia un parallelo tra la nascita dell’associazione delle famiglie e l’avvio di questo progetto: una forza condivisa fatta di impegno, coraggio e speranza, portata avanti da donne, ricercatrici e mamme. Il team FishCOLler, che oltre a me include le Dott.sse Graziamaria Paradisi e Valeria Bonavolontà, si arricchisce quest’anno della Dott.ssa Chiara Consorti, con esperienza nelle patologie del collagene. È un gruppo impegnato ogni giorno nella sfida contro le malattie rare, che unisce competenza scientifica e sensibilità verso le persone e le famiglie a cui la ricerca si rivolge”.

I RISULTATI DEL PRIMO ANNO DI RICERCA SUL GENE COL4A1

“Nel primo anno di lavoro abbiamo fatto un passo avanti molto concreto, sviluppando risorse sperimentali utili per comprendere la malattia e studiare le varianti genetiche di COL4A1. In particolare, abbiamo creato modelli in vivo che riproducono fedelmente ciò che accade nei pazienti, permettendoci di osservare direttamente gli effetti della perdita o del malfunzionamento del gene durante lo sviluppo. Abbiamo visto come i difetti genetici di COL4A1 causano alterazioni nella formazione del cervello, fragilità dei vasi sanguigni, con un rischio importante di emorragie, e problemi oculari, come difetti di sviluppo e cataratta. Partendo da varianti già note come patogenetiche, abbiamo validato il nostro modello dimostrando che è in grado di riconoscerle e distinguerle dalla forma sana del gene. Questo ci ha permesso di costruire una piattaforma sperimentale rapida che oggi può essere utilizzata per testare nuove varianti identificate nei pazienti, anche quando la loro rilevanza clinica non è ancora chiara e di fatto di accellerare la diagnosi con un’attenzione ad ogni caso”.

Lo studio ha inoltre iniziato a chiarire che la malattia non dipende solo da una proteina difettosa, ma anche da una riduzione della quantità di collagene IV funzionante nella matrice tra le cellule, fondamentale per garantire il corretto svilippo e mantenimento di diversi tessuti e organi. Questo risultato contribuisce alla discussione internazionale su come impostare possibili strategie terapeutiche.

“Grazie ad analisi sull’intero cervello nel modello animale, abbiamo mostrato per la prima volta che alla base delle emorragie possono esserci anomalie nello sviluppo e nella struttura dei piccoli vasi cerebrali, tra cui le arteriole cerebrali. Questa evidenza scientifica può contribuire a migliorare le linee guida cliniche attuali, introducendo metodi di monitoraggio mirati alla prevenzione degli eventi emorragici nei soggetti in cui si sono riscontrate mutazioni validate di COL4A1 e COL4A2. In sintesi, questo primo anno di ricerca ci ha permesso di costruire uno strumento sperimentale innovativo, rapido e concreto per accelerare e supportare la diagnosi e la valutazione dell’efficacia di future terapie. Abbiamo anche fatto passi avanti nella comprensione dei meccanismi della malattia, aprendo la strada a future strategie terapeutiche”, conclude Lauri.